Однако, сделавшись в 1521 г. императором, Карл предъявил свои ленные права на Северную Италию. Вскоре вновь началась война, поводом к которой послужила помощь Франции графу Марскому. Французский полководец Лотрек, имея сильную нужду в деньгах, не мог удержать Милана и сдал его в том же году испанцам. В апреле 1522 г. он был разбит в битве при Бикоке немецкими ландскнехтами. Императорские войска овладели всей Ломбардией. В мае в войну против Франции вступили англичане и начале наступление из Кале в Пикардию. Кроме внешних врагов, у Франциска появились внутренние. В сентябре 1523 г. перешел на сторону испанцев один из лучших французских полководцев коннетабль Бурбон. Под его началом испанцы вторглись в 1524 г. в южную Францию и осадили Марсель. Впрочем, экспедиция эта окончилась неудачей, и в сентябре испанцы отступили обратно в Италию. Франциск, преследуя их во главе своей армии, подступил к Павии. Осада этой сильной крепости продолжалась четыре месяца. В начале 1525 г. на помощь осаждённым подошла императорская армия. Положение французов сделалось опасным, так как с одной стороны их лагеря находился павийский гарнизон, а с другой – неприятельская армия. Опытные полководцы советовали королю не принимать сражения в такой рискованной обстановке. Но 24 февраля, когда испанцы проходили мимо французских позиций, направляясь в осаждённый город, Франциск приказал остановить их. Испанцы мужественно отразили атаку французской кавалерии, затем стали теснить её. Вылазка осаждённых довершила поражение Франциска. Король, под которым убили лошадь, оборонялся с большими мужеством, был два раза ранен, но в конце концов принужден сдаться в плен. Целый год его держали в крепости Пицигеттоне, а затем доставили в Мадрид. Тут он долго томился в одной из башен Мадридского замка. От безделья и грусти у несчастного короля развилась болезнь, казавшаяся смертельной. Тогда Карл навестил своего пленника и позволил сестре Франциска Маргарите посетить его в этом унылом уединении. При посредничестве Маргариты начались переговоры, окончившиеся в январе 1526 г. заключением договора, очень тяжелого для Франциска: король должен был отказаться от всех завоеваний в Италии, от ленного суверенитета во Фландрии и Артуа, согласиться на передачу Карлу Бургундии и обещал уплатить выкуп за своё освобождение в размере 3 млн. солидов. Франциск поневоле принял все эти требования, не собираясь, впрочем, исполнять их. Уже в мае 1526 г., возвратившись во Францию, король объявил императорскому посланнику, что считает Мадридский договор вынужденным и потому не чувствует себя им связанным. Он заключил в Коньяке ум. союз с папой, герцогом Миланским, Флоренцией и Венецией и постарался вернуть свои завоевания в Италии.